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CRISPR/Cas9,已经在2020年欧洲肝脏学术年会和2020年美国肝病年会上同时被提及。10月7日,2020年诺贝尔化学奖授予了2位女科学家在基因编辑领域的贡献,她们共同发现了CRISPR/Cas9基因编辑技术,在本届美国肝病研究年会(AASLD2020)上,CRISPR/Cas9再次被科学家提及在体外模型中,印证了对乙肝病毒基因组整合的肝癌细胞的影响
乙肝新药动态,基因编辑靶向HBx,AASLD介绍非抗病毒疗法
具体公布试验内容是这样的,来自Gautam Buddha大学等研究人员共同发表了使用基因编辑技术CRISPR/Cas9,设计合成HBx基因特异性微小RNA(sg RNA),在体外研究其对乙肝病毒基因组整合的肝癌细胞的HBx表达、乙肝表面抗原水平等特性。结果表明,这种新型基因编辑技术可以靶向HBx,并可以有效地降低肝癌细胞的上皮间质细胞转化和其干细胞特性(stemness)。
研究人员以硅作为工具,利用CRISPOR web设计带有微小脱靶错配并针对HBx的sg RNA,并通过克隆至非病毒eSpCas9-2A-Puro(PX459)V2.0载体(HBx-CRISPR)中。在体外模型中,使用HBx-CRISPR或对照载体PX459转染HepG2-2.15,即表达乙肝病毒的稳定肝癌细胞。运用免疫荧光、细胞集落形成、人乙肝表面抗原(HBsAg)ELISA检测试剂盒计算以及实时荧光定量PCR,分析了这种新设计的HBx-CRISPR。
运用这种新设计的HBx-CRISPR,切除了HBx编码基因长度为465 bp的HBx基因,在96小时后,可导致HepG2-2.15细胞中的HBX基因表达显著敲低。人B因子酶联免疫分析(ELISA)表明,96小时后,这种新设计的HBx-CRISPR,可使细胞上清液中的乙肝表面抗原水平下降达50%。在使用对照载体与pGFP-HBx转染细胞对比时,使用新设计HBx-CRISPR处理后的细胞,还呈现出细胞集落数量明显降低。
研究人员发现,在使用免疫荧光分析时,和对照转染细胞进行比较,观察到被HBx-CRISPR处理后的细胞当中,上皮钙黏蛋白(CDH1)表达增强,并且波形蛋白的表达下降。基因表达研究时,研究人员观察发现,在和对照组与pGFP-HBx转染细胞进行比较时,使用新设计的HBx-CRISPR处理过的细胞的VIM基因显著下降,但上皮钙黏蛋白基因显著上调。
综合来讲,2020年美国肝病研究年会上,研究人员再次介绍了这种新基因编辑技术CRISPR/CAS9,在靶向HBx方向能够有效地降低慢性乙肝-肝癌细胞的HBx基因表达、乙肝表面抗原水平和上皮间质细胞转化和其干细胞特性。研究结果进一步证明,1种有效控制HBV诱导相关肝病肿瘤进展的非抗病毒治疗方法的可行性。
什么是CRISPR/CAS9?它是2020年10月7日,2位诺贝尔化学奖得主分别是詹妮弗·杜德纳 (Jennifer Doudna),美国生物学家和埃马纽埃尔·卡彭蒂耶 (Emmanuelle Charpentier),法国微生物学家、遗传学家和生物化学家共同发现的。2020年诺贝尔化学奖主要是表彰其开发的基因编辑方法作出的贡献。CRISPR的英文全名为Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats;
可以译为规律成簇的间隔短回文重复。这项技术需要修改细胞中的基因,运用被称为基因剪刀的CRISPR/Cas9,有望在数周内改变生命密码。来自诺贝尔化学委员会主席Claes Gustafsson原文评述观点:基因工具潜力巨大,它会影响我们所有人,它不但是彻底改变的基础科学,还会引领新的创新药物,并带来更具突破性的新医学疗法(以上关于CRISPR/Cas9靶向HBx降低肝癌细胞和基因编辑应用,来自AASLD2020和10月7日诺贝尔化学奖原文点评)。
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